为榜样我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测，共鸣从考验前、中、后次第及其质地确推荐行仔细分析，并提出针对性倡导，为尝试室发展该检测项目供给参考，以促使我国血清(浆)类固醇激素检测运用结果类似性

　　液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)正在人体血清(浆)类固醇激素检测中显暴露优于古代免疫学形式的特异性高、理解衡量限造宽、多记号物同时检测等特性，已成为国际内渗出学界限联系疾病尝试室诊断的首选形式。目前，国内医学尝试室发展血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测多参考已颁发学术论文和仪器厂家仿单供给的通用操作和检测次第。

　　然而，血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测的本领难度大，临床尝试室考验职员大无数欠缺质谱界限专业培训和实施阅历，而通用次第缺乏针对性和实操性，更加我国尚无针对该检测次第和质地确保的体系性文献，导致尝试室间检测结果存正在较大分歧，停滞了该本领的临床运用。

　　类固醇激素是一类拥有环戊烷多氢菲母核的脂肪烃化合物，凭据化学构造及心理功效可分为肾上腺皮质激素(糖皮质激素、盐皮质激素)、性激素(雌激素、雄激素、孕激素)及维生素D [ 1 ] ，正在人体滋长发育、能量代谢、免疫安排、生育功效安排等方面阐述首要功用。血清(浆)类固醇激素分表与禀赋性肾上腺皮质增生(congenital adrenal hyperplasia，CAH)、原发性醛固酮增加症、库欣归纳征、多囊卵巢归纳征(polycystic ovary syndrome，PCOS)、儿童发育延迟或性早熟等多种内渗出疾病亲密联系 [ 2 ] ，因而其检测普通运用于多种内渗出疾病的临床探索、诊断以及矫健评估。古代免疫学形式假使主动化水平高，但特异性相对不敷，且线性限造窄，难以完毕精准检测。液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)具备特异性高、理解衡量限造宽等机能上风，且能正在短工夫内同时确凿测定多品种固醇激素及中央代谢产品，是目前精准、周详定量理解血清(浆)类固醇激素的首选形式 [ 3 , 4 ] 。

　　假使已有浩瀚探索报道多品种固醇激素的LC-MS/MS检测，征求形式开拓和优化 [ 5 , 6 ] 、生物参考区间开发 [ 7 ] 等，表洋已有针对血清(浆)雄激素、雌激素LC-MS/MS检测次第的指南 [ 8 ] ，国内有LC-MS/MS临床运用通用倡导共鸣及25羟-维生素D和雄激素LC-MS/MS检测的共鸣 [ 9 , 10 , 11 ] ，但依旧缺乏涵盖考验前、中、后阶段的LC-MS/MS检测操作次第和质地确保的指南和共鸣。基于此，为榜样我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测，中国质谱学会临床质谱专家委员会结构专家参阅国表里联系文件并联合临床运用阅历，面向医学尝试室临床质谱考验职员，针对肾上腺皮质激素和性激素LC-MS/MS理解全流程的质地确推荐行仔细分析并提出倡导，为尝试室发展血清(浆)类固醇激素检测项目供给参考，以促使我国血清(浆)类固醇激素检测的临床运用和结果类似性，晋升我国类固醇激素分表联系疾病的精准诊断才能。

　　人体类固醇激素浓度受多种身分影响，征求日夜节律、心理周期、采血和药物等，应凭据临床的确需乞降激素秤谌影响身分，拟订合理采样流程，并推举给标本搜罗职员和患者。比如：皮质醇渗出平淡正在清晨6：00—8：00抵达峰值浓度，因而峰值监测推举清晨搜罗患者血液标本;持续监测则采样工夫点应相对固定 [ 12 ] ;醛固酮仰卧位采血比直立位采血检测结果低50% [ 13 ] ;女性患者举行血清(浆)雌激素检测时需显然卵泡期、黄体期等讯息，看待无法则月经周期女性，需显然绝经(万分是早绝经)来由，如天然绝经、表科手术、辐射、药物功用等 [ 14 , 15 ] 。

　　含有折柳胶的促凝管中存正在睾酮骚扰峰，且折柳胶可汲取类固醇激素，标本体积和积储工夫也可差别水平影响检测结果 [ 16 ] 。再生儿CAH二级筛查中，EDTA采血管可导致17α-羟孕酮、雄烯二酮及11-脱氧皮质醇的LC-MS/MS检测结果偏高，变成假阳性 [ 17 ] 。此表，改换采血管品牌或批号也不妨影响待测物色谱峰折柳度，应拟订征求峰折柳度、保存工夫漂移限造等色谱参数的可继承准则，以监测潜正在骚扰峰的影响强弱及转移。

　　倡导1 针对有日夜和/或周期节律的类固醇激素，尝试室应凭据其临床预期用处，指挥患者和采血职员选取适合的采血机会，比如清晨采血检测皮质醇、睾酮秤谌，卵泡期采血检测雌激素秤谌。推举采用不含折柳胶的血清(浆)采血管搜罗标本，再生儿二级CAH筛查推举采用肝素抗凝剂采血管。

　　尝试室应凭据类固醇激本质谱检测的标本保留前提及检测频率举行标本的牢固性验证 [ 18 ] 。标本牢固性验表明验应起码征求境况温度、冷藏和/或冷冻前提下的牢固性，即使标本存正在冻存后复查的不妨，还需调查屡次冻融对标本牢固性的影响。此表，标本搜罗、运输及前收拾阶段的牢固性也需举行评估。标本牢固性尝试均需应用奇怪血清(浆)，通过比力奇怪搜罗和保留后的血清(浆)标本检测结果评估其牢固性。

　　即使尝试室凭据参考文件报道或试剂仿单筑设标本保留前提，需包罗显然的牢固性、标本类型、类固醇激素浓度、保留温度限造、保留工夫以及保留后标本浓度较奇怪标本的转移百分比。为确保标本保留后类固醇激素检测结果“牢固”或“无昭彰转移”，需显然衡量次第、含量推算次第及含量转移的可继承限造。即使这些讯息缺失，尝试室应自行开发标本牢固性的可继承前提。

　　倡导2 尝试室应凭据标本保留的实质需求，应用奇怪标本对来自文件报道或试剂仿单的标本牢固性举行验证，或自筑牢固性可继承的标本保留前提。倡导血清(浆)标本中类固醇激素牢固保留的前提及工夫见 表1 。

　　标本前收拾形式取决于待测物的理化性子、灵巧度央乞降理解形式。其宗旨是将待测物从血清(浆)及其他潜正在骚扰物质平折柳、提取、纯化，并完毕看待测物的浓缩。大无数糖皮质激素(如17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、皮质醇、可的松)和盐皮质激素(如孕烯醇酮、孕酮、脱氧皮质酮、皮质酮)为疏水构造，均可与相应转运卵白联合存正在于血液中，游离花样约占1%。但血液中，约50%醛固酮以游离花样存正在。睾酮和雌二醇与白卵白联协力弱，与性激素联合球卵白(sex hormone binding globulin，SHBG)联协力强，2%~4%睾酮呈游离花样，60%~75%睾酮与SHBG联合，20%~40%睾酮与白卵白联合 [ 1 ] 。均衡透析可去除血中联合型类固醇激素进而检测游离型激素秤谌，但衡量次第央求更高的灵巧度。即使联合型类固醇正在水解前无法被直接检测，则需水解后举行检测，并显然联合型类固醇是否完整水解，且水解办法不会导致类固醇降解，如硫酸雌酮正在提取之前需通过水解酶取得游离型雌酮。亲脂性性激素(雄烯二酮、睾酮、双氢睾酮、雌酮、雌二醇、雌三醇)较亲水性性激素(硫酸脱氢表雄酮、硫酸雌酮)正在血液中浓度低，因而亲脂性性激素的LC-MS/MS衡量次第平淡需求更庞杂的标本前收拾以杀绝基质骚扰并浓缩待测物以抵达理念的定量限(limit of quantification，LOQ)。

　　血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测的标本前收拾流程平淡征求：(1)取等量临床标本、准则品、质控品和基质空缺;(2)出席内标物;(3)提取;(4)纯化 [ 19 ] 。对易氧化的类固醇激素，前收拾时需尽不妨避免发作氧化以防待测物降解及爆发骚扰物。比如，正在样品浓缩时应用惰性气体(如氮气)，而非加热真空离心浓缩。去除可醒目扰检测或影响前收拾的物质后，宜将理解物转动到液相色谱活动相洗脱溶剂中，依旧初始浓度比例，以备后续理解。推举应用与待测物拥有形似构造和离子化性子的同位素标志物(或构造相仿物)举动类固醇激素LC-MS/MS检测内标物，比如氘代或 13C标志的类固醇。通过比力已知浓度内标物与待测物的信号，校正样本前收拾、色谱折柳、离子化历程及基质效应所爆发的差错。类固醇激素的同位素内标物公多为商品化试剂，如无商品化试剂，应优先选取应用非内源性但与待测物构造相仿的合成类固醇举动内标物，并确保内标物与待测物拥有无别或左近保存工夫。内标物的相对分子质地应起码比相应待测物大3，氘代或 13C标志数目职掌正在7，化学纯度应≥98%，同位素内标物纯度≥97%。

　　内标物需出席到统统校准品、质控品和待测标本中，且应正在提取或纯化办法之前或同时出席。出席内标物后需静置足够长的工夫(平淡15~30 min)以均衡内标物与联合卵白的互相功用，抵消因卵白联合导致的检测浓度偏低，如睾酮和睾酮-d 3需30 min杀青均衡(22 ℃)。内标物的质谱信号强度应正在差别理解批次中依旧牢固，均衡工夫不敷不妨会导致内标物信号强度不牢固。

　　倡导3 应用与待测物有无别理化性子的商品化同位素标志物举动类固醇激素LC-MS/MS检测内标物( 表2 )，浓度筑设正在校准弧线的中浓度或医学断定秤谌邻近，尝试室应拟订内标物信号强度动摇的批间可继承限造。

　　血液中存正在的大方卵白质、多肽、幼分子化合物等可惹起LC-MS/MS的离子源和检测器饱和，导致离子压抑或分别率不敷，骚扰检测结果。因而，LC-MS/MS理解前应提取待检测物，去除无机化合物(如盐)、卵白质、脂质(如甘油三酯)和磷脂等物质的骚扰，降低检测灵巧度、反复性和牢固性。

　　LC-MS/MS理解标本的提取形式征求卵白浸淀(protein precipitation，PPT)、液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)、固相萃取(solid-phase extraction，SPE)等。PPT行使卵白浸淀剂使卵白变性浸淀，离心后直接取上清液举行检测，不对用于含量较低或有卵白联合特点的类固醇激素。LLE行使溶剂的形似相溶道理，将对象化合物从液体夹杂物平折柳出来，因操作繁琐且需求损耗大方有机溶剂，故临床常用固相支柱液液萃取(supported liquid extraction，SLE)代替古代LLE，下降有机溶剂损耗。而SPE采用固体颗粒色谱填料(平淡填充于幼柱型装配中)对样品差别组分举行化学折柳，较SLE拥有更优的去磷脂骚扰才能，是类固醇激素标本提取的首选形式，但也拥有操作办法多、本钱上等谬误。针对类固醇激素的差别极性，脂溶性激素平淡选取亲脂基团填料的SPE形式萃取待测物，非脂溶性激素选取亲水基团或阴阳离子相易填料的SPE形式萃取待测物。为进一步去除与待测物合伙洗脱的骚扰物，可纠合LLE和SPE，或吹干提取物后用差别溶剂从新提取。此中，通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)可正在线举行SPE，以淘汰手工操作，俭省工夫和人力本钱，但目前尚无多品种固醇激素正在线SPE提取管理计划。也有通过应用单个或多个提取柱串联色谱柱，如提取/上样柱、一次性SPE柱、二维色谱，降低色谱折柳效果和检测灵巧度，使血清(浆)标本无需或只需经简易卵白浸淀收拾即可举行理解。

　　LC-MS/MS通过联合HPLC的高效折柳浓缩才能与三重四极杆质谱的高特异性和高灵巧度定量机能，确凿衡量标本中浓度极低、理化性子形似的类固醇激素，其特异性较免疫学理解昭彰降低。

　　1. HPLC折柳：HPLC是一种基于待测物正在固定相和活动相中拥有差别分拨系数的折柳本领。平淡应用对非极性分子拥有高亲和力的非极性固定相(如 18C、五氟苯基等)色谱柱折柳类固醇激素 [ 20 ] ，通度日动相极性转移将吸附于色谱柱上的类固醇激素从新溶于活动相，从而完毕慢慢洗脱折柳。通过开拓稹密的活动相梯度洗脱次第和应用适合的色谱柱能够折柳构造相当形似的类固醇激素及其代谢物，征求少许同分异构体(如21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇)。通过按序洗脱标本中统统待测物，下降检测信号的庞杂度，折柳组分信号随工夫映现一组近似高斯分散的色谱峰群，天生检测信号强度随工夫转移的色谱图。此表，活动相中平淡出席挥发性增加剂(如0.01 mol/L甲酸铵、0.1%甲酸)，其浓度不应凌驾0.5%，以巩固化合物离子化，而不应含非挥发性活动相增加剂。色谱柱可选取粒径较幼的折柳柱，完毕短工夫内更好的折柳成效，也可凭据文件归纳选取。色谱柱应正在寿命刻期内应用，并凭据检衡量、峰型、保存工夫、折柳度、柱压等参数决断是否需求改换。尝试室应做好色谱柱的通常保卫，正在逐日检测完结后举行通常冲刷次第，并最终将色谱柱依旧正在95%及以上的甲醇或乙腈中，尽不妨地耽误色谱柱的应用寿命及应用质地。

　　2. 串联质谱检测：类固醇激素LC-MS/MS衡量次第应用的离子源厉重征求电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)和大气压化学电离(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)。正在老例临床检测中，醛固酮、皮质醇、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、可的松、睾酮、孕酮、17α-羟孕酮、皮质酮、雄烯二酮、脱氢表雄酮可采用ESI或APCI离子源。与ESI比拟，APCI离子源温度更高，脱溶剂更充裕，因而基质效应更幼。然而，APCI更合用极性较幼的类固醇激素，如3β-羟基-5-烯类固醇 [ 21 ] ，正在需同时检测多个类固醇激素的临床运用中拥有节造性。

　　类固醇激素分子经离子源电离落后入三重四极杆质地舆解器，凭据质荷比举行折柳，并采用多响应监测(multiple reaction monitoring，MRM)或选取响应监测(selected reaction monitoring，SRM)形式搜罗数据。最终借帮质地舆解器选取特定母离子和子离子，通过母离子/子离子对和各理解物及内标物的色谱图及峰面积对对象化合物举行定量。差别仪器，其离子对讯息及检测参数并不完整无别，每个化合物平淡选取2个离子通道分歧举动定性离子和定量离子通道( 表3 )。基于定性离子、化合物极性及内标物折柳峰归纳决断对象化合物的折柳峰。

　　倡导6 类固醇激素LC-MS/MS检测选取ESI或APCI离子源，采用MRM或SRM形式，应正在机能验证时优化质谱参数。

　　3. LC-MS/MS衡量次第机能验证和/或确认：衡量次第的机能央求取决于其预期临床用处、待测类固醇激素生物学变异及仪器灵巧度秤谌。如检测女性、儿童血清睾酮，衡量次第的灵巧度需求抵达0.02 ng/ml;同时检测浓度分歧大的多个理解物，如雌二醇、雌酮、雄烯二酮，需验证衡量次第对每个理解物的理解机能是否餍足临床需求。值得提神的是，因为血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量次第包罗的人为操作办法多，各尝试室境况前提、仪器兴办装备、职员秤谌相差大，因而纵使尝试室应用商品化试剂盒(Ⅰ、Ⅱ类)，也应举行机能确认或验证。LC-MS/MS衡量次第机能验证和/或确认次第可参考共鸣 [ 22 ] 或美国临床和尝试室准则协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)C62-A [ 23 ] ，并凭据生物变异、临床指南、战略法例等设定机能验证中每项参数的可继承准则。

　　类固醇激素联系疾病的临床诊断对检测目标及灵巧度有差别需求，尝试室应归纳临床需求及仪器灵巧度确定LC-MS/MS衡量次第理解机能。

　　1.肾上腺皮质激素：皮质醇是最厉重的肾上腺皮质激素(约占75%~95%)，血液中总皮质醇、游离皮质醇秤谌及日夜节律转移常用于辅帮诊断原发性和继发性肾上腺功效不全、库欣归纳征、艾迪生病。寻常成人清晨血清总皮质醇浓度平淡正在20~50 ng/ml，经均衡透析后的游离皮质醇浓度约占总皮质醇5%，可更确凿响应皮质醇秤谌及节律，推举检测血清(浆)游离皮质醇(LOQ≤1 ng/ml)。皮质醇纠合17α-羟孕酮、雄烯二酮常用于筛查11-羟化酶或21-羟化酶缺乏型CAH。大无数(约90%)CAH由21-羟化酶基因变异导致，患者血清雄烯二酮秤谌平淡升高5~10倍，17α-羟孕酮秤谌升高幅度更大，而皮质醇秤谌较低或无法检测。差别年齿、性别人群17α-羟孕酮及雄烯二酮秤谌分歧较大，推举尝试室检测17α-羟孕酮(LOQ≤0.1 ng/ml)，检测区间上限设定正在参考区间上限10倍以上 [ 24 ] 。

　　硫酸脱氢表雄酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮常用于已摈斥11-羟化酶、21-羟化酶缺乏型CAH，及确认3β-羟基类固醇脱氢酶缺乏和17α-羟化酶缺乏型CAH。正在相当罕见的17α-羟化酶缺乏症中，雄烯二酮、统统雄激素前体(17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮、硫酸脱氢表雄酮)、睾酮、雌酮、雌二醇和皮质醇秤谌下降，而盐皮质激素(孕酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮)秤谌昭彰升高。醛固酮是楷模的盐皮质激素，常用于辅帮诊断原发性醛固酮增加症(如肾上腺肿瘤、肾上腺皮质增生)和继发性醛固酮增加症(如肾血管疾病、盐耗竭、钾负荷、肝硬化腹水、心力衰竭、受孕、Bartter归纳征)，以上情景醛固酮秤谌平淡可升高10~100倍。因而，倡导醛固酮LOQ≤0.02 ng/ml，检测区间上限设定正在参考区间上限100倍( 表4 )。

　　2.雄激素：LC-MS/MS较易检测寻常成年男性雄激素秤谌，但对低雄激素秤谌人群，如女性、儿童以及性腺功效减退的男性，则央求衡量次第拥有更高的灵巧度。对成年女性，睾酮秤谌平淡用于评估由肾上腺合因素表和PCOS导致的高雄激素血症及联系的女性多毛症、月经纷乱、不孕等疾病。对儿童，睾酮秤谌平淡用于评估表生殖器性别恍惚、性早熟或发育延迟，以及用于CAH的诊断。倡导女性或儿童的睾酮衡量次第LOQ≤0.02 ng/ml，并需装备高灵巧度LC-MS/MS体系，并对样品举行离线或正在线前收拾，如LLE、SPE或多个提取办法联合(如PPT联合SPE) [ 8 ] 。

　　双氢睾酮以及双氢睾酮/睾酮比值可用于诊断雄激素缺乏症、监测雄激素代替调养或5α-还原酶压抑剂疗效，倡导采用双氢睾酮非衍生化法LC-MS/MS检测(LOQ≤0.05 ng/ml)。雄烯二酮还可用于诊断和评估女性高雄激素血症、多毛症、不孕症，儿童性早熟、发育延迟、CAH，以及肾上腺、性腺肿瘤。正在CAH、女性高雄激素血症等疾病中，雄烯二酮秤谌昭彰升高，但正在3β-羟基类固醇脱氢酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症及类固醇合成急性安排卵白缺乏症等罕见病及2岁以下儿童中，其秤谌较寻常成人昭彰下降，倡导其LOQ≤0.02 ng/ml。雄烯二酮检测的子离子与睾酮子离子拥有无另表质荷比，因而尝试室需验证睾酮和雄烯二酮的色谱折柳度。

　　脱氢表雄酮和硫酸脱氢表雄酮除纠合肾上腺皮质激素用于CAH辅帮诊断以表，还可用于识别诊断肾上腺功效不全或亢进。与性激素纠合可用于区别肾上腺功效初现与性早熟，诊断儿童CAH和女性PCOS。儿童脱氢表雄酮秤谌较低(平淡1~8岁儿童

　　倡导7 尝试室应凭据临床需求、待测类固醇激素生物学变异及仪器灵巧度秤谌，开发理解机能餍足央求的类固醇激素LC-MS/MS衡量次第( 表4 )。

　　1. 量值溯源：量值溯源是通过一条拥有显然不确定度的不间断传达链，使衡量结果的量值也许与划定的参考准则(国度或国际计量准则)相合起来 [ 28 ] 。类固醇激素量值的可溯源性是实实际验室间衡量结果类似的基本，即统一标本正在差别工夫和场所采用差别衡量次第取得确凿衡量结果。尝试室应参考国际准则化结构(International Organization for Standardization，ISO)17511文献及中国及格评定国度认同委员会合于衡量结果的计量溯源性文献央求开发计量溯源链，中心因素征求被测物、参考物质、校准及赋值次第、衡量结果验证 [ 28 ] 。

　　尝试室应参考国际临床化学和考验医学纠合会/国际纯粹与运用化学纠合会文献显然被测物属性，征求理解物特点(如化学花样)、衡量基质、单元等;可通过考验医学溯源纠合委员会网站或国度准则物质资源共享平台盘查参考物质讯息，并优先选取拥有显然溯源讯息的参考物质(如有证参考物质)举动校准品。对无有证参考物质的类固醇激素，尝试室应参考CLSI EP30评估校准品的特点、纯度、均一性、牢固性及互通性并拟订联系评估次第 [ 29 ] 。

　　需显然的是，计量溯源链自身并不直接确保衡量结果真实凿性和类似性，溯源链中每次量值传达都邑新增衡量不确定度，衡量真实凿度和不确定度也不妨正在应用新校准品或仪器大修后革新，尝试室应通过检测校准品、参预才能验证部署或尝试室间比对，显然衡量次第的无误度和稹密度。

　　2. 校准：校准是确定或校正质谱仪检测信号强度与待测物浓度之间的联系性。平淡将校准物质出席到经活性炭收拾、不含待测类固醇激素的简单泉源或夹杂血清(浆)基质中以造备一系列稀释校准品。类固醇激素LC-MS/MS衡量次第机能验证、改换试剂或校准物批号后，需确定每个理解批校准弧线的斜率、截距和联系系数的可继承准则。每个理解批都需举行校准，即使一个理解批包罗的样品许多，校准品可正在理解批差别位子进样，并监测每个校准品检测值与表面值的偏倚，以显然正在大样本量理解中的校准漂移情景。

　　校确凿认是采用与检测临床标本无另表衡量次第，理解正在呈文限造内已知待测物浓度的标本或商品化室间质地评判(external quality assessment，EQA)质控物以确认仪器或检测体系的校准，验证正正在应用的校准弧线正在检测患者标本时依旧有用。倡导正在改变准则品批次后、确认差别理解批之间的校准有用性时，发展校确凿认。校确凿认品应与实质患者标本无别或拥有形似的性子，并与患者标本举行无另表前收拾。与患者标本基质差另表质控品和校准品不成举动校确凿认品。

　　3. 室内质地职掌：血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量次第室内质控的难点是获取与患者标本基质左近且牢固性好的质控品。看待多组分理解的血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量次第，应优先选取分娩质控厉酷、牢固性显然，并同时包罗多个待测组分的商品化质控品。应用经收拾的血清(浆)、冻干或合成基质质控品的一个昭彰谬误是，因与患者标本基质不完整无别而爆发差另表质谱反应。而未增加理解物的患者血清(浆)质控品不妨正在评估衡量次第机能时比历程收拾的质控品更牢靠。如通过将类固醇纯溶液准则品增出席基质造备质控品，用于造备质控品的类固醇准则品批号及基质应有别于造备校准品的类固醇准则品及基质。此表，尝试室可应用低、中、高浓度的单个或夹杂患者样本举动质控品。为了确保质控结果解读的类似性，质控样品应多量量造备，分装积储，并显然质控品的积储牢固性及与患者标本基质的类似性。

　　尝试室应自行确定质控物靶值及最大应承不稹密度( 表4 )，将质控物睡觉正在每一理解批内和理解批间的差别位子检测，以监测衡量次第的批内、批间漂移情景。可参考《临床考验定量测定室内质地职掌 WS/T641-2018》 [ 30 ] 开发衡量次第的质控计划和失控法规(如1 3 s 、3 2 s 等)，以及失控后收拾方法，如理解批内质控不足格，应复测标本。

　　倡导10 尝试室应优先选取质地牢靠、与患者标本基质类似的质控物，确定质控物靶值及最大应承不稹密度，开发质控计划、失控法规和收拾方法。

　　4. 理解批筑设：血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量通常分批举行，理解批的长度取决于体系校准牢固性和本钱效益。一个楷模的理解批应包罗校准品、质控品、患者样本、空缺样品、校确凿认品(用于验证校准弧线的有用性，非必要)。尝试室通过校准弧线、质控和校确凿认监测每个理解批的有用性。当检衡量大于2×96个时，倡导每检测批次(96个/批次)都包罗校准品、质控品和空缺样本。尝试室应确定并文献化血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量次第的理解批长度 [ 31 ] 。

　　倡导11 尝试室应凭据血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量体系的牢固性和本钱效益确定理解批的长度，并通过校准弧线、质控和校确凿认监测每个理解批的有用性。

　　5. 才能验证/室间质地评判：因为血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测次第准则化不敷，基于分组数据举行衡量结果类似性评估的EQA部署代价有限。无误度验证部署可同时监测衡量次第的无误度和类似性，尝试室应按期(1~2次/年)参预国度卫生矫健委和/或省级临床考验中央无误度验证部署，如卫生矫健委临床考验中央结构的类固醇激素无误度验证。无误度验证部署应用经起码次第收拾的临床样本，通过参考形式对类固醇激素定值后，用于评估参评尝试室LC-MS/MS衡量次第的无误度和量值溯源性。对无无误度验证和室间质地评判部署的类固醇激素LC-MS/MS检测项目，尝试室需按期(如2次/年)举行尝试室间比对，并应优先选取通过ISO15189认同的尝试室，以保表明验室间结果的类似性。

　　倡导12 尝试室应按期(1~2次/年)参预国度卫生矫健委和/或省级临床考验中央结构的类固醇激素检测才能验证部署，无才能验证部署的项目需按期(2次/年)举行尝试室间比对。

　　尝试室应开发患者样品、空缺样品、校准品和质控品的数据收拾、峰积分的准则操作次第，并正在每一次临床检测中依旧类似。数据收拾软件应带有审核追踪功效可盘查每个样品的数据收拾形式。

　　1. 校准弧线继承准则：以校准品/内标物浓度比值为 X轴、理解物/内标物反应比值为 Y轴，修建校准弧线，将每个患者样品、质控品和空缺样品的理解物/内标物反应比值代入校准弧线方程推算被测物浓度。理解患者标本时应用的校准弧线回归形式应与举行衡量次第机能验证时应用的形式依旧类似，大无数情景采用线性回归。即使校准弧线数据方差差别质(差别浓度点分歧差别)，推举应用1/ x或1/ x 2权重回归理解以使低浓度校准点的偏倚正在可继承限造。尝试室应通过张望每个校准浓度点的相对过错或总相对过错选取适合的权重理解形式。

　　血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量次第机能验证应显然校准弧线可继承准则：应用校准弧线推算出的校准品浓度与表面浓度之间偏倚可继承限造为85%~115%(LOQ浓度点：80%~120%)。确定校准弧线斜率和截距的可继承准则，推算联系系数、确定其继承限造(平淡需>

　　0.99)，并运用于老例理解的评估。校准弧线的可继承准则应与衡量次第机能(如确凿度)完婚。

　　倡导13 血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS衡量校准弧线推算的校准品浓度与表面浓度之间偏倚的可继承限造推举筑设为85%~115%(LOQ浓度点：80%~120%)。

　　2. 色谱峰积分：应正在类固醇激素LC-MS/MS老例检测中通过优化积分参数杀青色谱峰的主动积分，以尽量避免操作职员手动积分导致的不类似性。平淡应用3倍LOQ浓度类固醇激素样品的色谱峰优化主动积分参数。对色谱峰举行腻滑收拾可晋升积分确凿性，仪器后台杂质信号过高或色谱峰搜罗数据点不敷可导致色谱峰不敷腻滑。但色谱峰太过腻滑会导致峰形变宽和失落细节，如将肩峰腻滑进待测物的色谱峰，将影响待测物定量结果确凿性。看待采样率较慢的体系，可应用成组腻滑形式减幼后台杂质信号的影响。阅历性色谱峰腻滑参数应正在统统样品理解中依旧类似。

　　倡导14 应尽量通过优化积分参数杀青每个待测类固醇激素的色谱峰主动积分，避免手动积分，实质标本检测需同一峰积分、腻滑参数。

　　3. 色谱峰核查：正在类固醇激素LC-MS/MS衡量次第机能验证时，应开发色谱峰保存工夫、后台杂质信号强度、峰形和峰分别率的核查法规。理念的色谱峰是对称的且基线折柳完善。即使一个理解批内有样品色谱峰基线折柳不完善、峰形变宽或裂分，摈斥管途相联不无误的来由，应试虑改换色谱柱。尝试室必需核查色谱峰的保存工夫以确保待测物理解峰的无误积分，并正在准则操作流程中显然保存工夫的最大应承漂移限造，理解批间的转移应不凌驾±2.5%。样品平理解物色谱峰的保存工夫应与校准品的保存工夫类似。尝试室可采用人为核查色谱峰，也可通过正在仪器职掌软件中筑设色谱峰核查参数主动杀青。即使应用主动色谱峰核查，尝试室需验证主动核查参数及流程的有用性，同时显然需人为介入核查的情景。

　　倡导15 尝试室应开发每个待测类固醇激素的色谱峰保存工夫、后台杂质信号强度、峰形、峰分别率的核查法规和应承限造。

　　4. 内标峰面积核查：通过推算每个类固醇激素LC-MS/MS检测样品内标峰面积与校准品均匀峰面积的比值确定每个样品的内标峰面积接纳率。内标接纳率用于校正理解物提取接纳率，每个样品内标峰面积差别是可继承的，但正在机能验证时应开发样品之间内标峰面积蜕变的最大可继承限造。样品内标峰面积接纳率映现昭彰下降提示前收拾效果低或存正在其他可导致离子压抑的骚扰物或存正在骚扰内标定量离子对的杂质峰。看待内标峰面积比前后样品少2/3或50%的样品，应复检。昭彰升高的接纳率提示内标峰包罗骚扰峰，也需复检。可通过内标峰面积随进样量转移作图，识别过低或过高的接纳率。

　　倡导16 尝试室应通常监测每个待测类固醇激素的内标峰面积正在准则品、质控物及标本间的动摇，开发内标峰面积动摇的最大可继承限造。

　　5. 定性离子对监测：类固醇激素LC-MS/MS老例检测中，一个离子对用于定量理解(定量离子对)，另一个离子对用于定性理解(定性离子对)。定性离子对用于理解物定性，正在识别样品骚扰物中阐述首要功用。定量离子对峰面积与定性离子对峰面积的比值正在差别样品间应依旧类似，即使发作转移则提示存正在骚扰物质。即使无法检出定量或定性离子对则提示样品中不存正在该理解物或存正在骚扰物，应进一步理解来由。应同时评估理解物和内标物的定量离子对/定性离子比照值。定性离子对应正在总共衡量区间有牢固的反应，避免应用脱水分子、脱乙酰基、脱甲基或加合物的子离子筑设定性离子对。衡量次第机能验证时应开发定量/定性离子比照值分歧的可继承限造(如±30%)，并正在每一个样品检测中予以监测。

　　倡导17 尝试室应通常监测每个待测类固醇激素的定量/定性离子对峰面积比值正在准则品、质控物及标本间的动摇，并筑设最大可继承限造。

　　1.数据存储：尝试室应保留血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS理解爆发的完善原始数据和收拾数据，征求衡量次第应用的色谱和质谱参数筑设、每个离子对的色谱和质谱数据等，需要时应用独立体系备份数据。

　　2.参考限造：因为抗原抗体非特异性响应及与LC-MS/MS衡量结果的过错，采用免疫法开发的类固醇激素参考限造通常不对用于LC-MS/MS衡量次第，然而我国目前尚未开发公认同一的类固醇激素LC-MS/MS检测参考限造，尝试室可参考CLSI EP28针对对象检测人群验证表洋巨头机构开发的参考限造 [ 32 ] ，差别类固醇激素需按性别、年齿和/或月经周期分组，比如绝经前妇女的雌二醇、雌酮和雌三醇的浓度因月经周期或受孕阶段的差别而有较大分歧。

　　倡导18 尝试室可针对对象检测人群验证表洋巨头机构开发的类固醇激素LC-MS/MS参考限造，推举开发中国人群的参考限造。

　　3.结果解读及呈文：肾上腺皮质激素代谢终产品醛固酮和皮质醇浓度增高分歧和醛固酮增加症和皮质醇增加症(库欣归纳征)亲密联系;17α-羟孕烯醇酮、17α-羟孕酮及其雄激素代谢产品(如脱氢表雄酮、雄烯二酮)秤谌的分表往往与女性PCOS、高雄激素血症及性发育分表等内渗出疾病联系;绝经后女性雌二醇检测是乳腺癌发病危机评估的合节;对女性和芳华期前儿童体内睾酮的检测是识别儿童性早熟、女性高雄激素血症和PCOS的合节;对峰谷游离皮质醇真实凿检测可有用辅帮诊断库欣归纳征;对17α-羟孕酮、雄烯二酮、孕烯醇酮、孕酮、17α-羟孕烯醇酮、11-脱氧皮质酮和18-羟皮质酮真实凿检测是确定CAH亚型的首要依照。另表，血清(浆)类固醇激素检测结果的解读应基于对象患者某人群的根本讯息，如性别、年齿、心理期、日夜节律及立卧位等，对结果解读拥有首要参考道理。因而，尝试室应为类固醇激本质谱检测的对象人群开发性格化的结果解读法规。为了呈文真实凿性，类固醇激素结果的解读还应联合类固醇代谢通途和临床发轫诊断。

　　倡导19 尝试室应联合患者临床讯息、形式机能、临床预期用处、类固醇代谢通途解读和呈文血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测结果。

　　血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测正在准确评估类固醇激素秤谌、诊断类固醇激素失衡联系疾病(如CAH、肾上腺功效不全、高雄激素血症等)、监测调养成效中阐述着越来越首要的功用。本共鸣对血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测全流程举行了仔细分析，征求标本搜罗、保留、运输及前收拾的考验前历程，LC-MS/MS定量理解形式、理解机能目标、质地确保、数据搜罗及理解的考验中历程，以及数据存储、参考限造、结果解读及呈文的考验后历程，并提出19项针对性倡导供尝试室参考。本共鸣旨正在榜样我国血清(浆)类固醇激素LC-MS/MS检测次第，晋升其检测质地和结果类似性，促使其临床运用。

　　执笔人：李霖(四川省医学科学院 四川省国民病院临床医学考验中央)，蒋黎(四川省医学科学院 四川省国民病院临床医学考验中央)，郭玮(复旦大学附庸中山病院考验科)，邱玲(中国医学科学院 北京协和病院考验科)

　　专家构成员(以姓氏拼音排序)：曹正(首都医科大学附庸北京妇产病院考验科)，戴锦娜(中国医科大学附庸第一病院考验科)，俸家富(绵阳市中央病院考验科)，郭启雷(山东英盛生物本领有限公司)，郭玮(复旦大学附庸中山病院考验科)，郭晓兰(川北医学院附庸病院考验科)，黄庆[陆军军医大学附庸大坪病院(陆军特性医学中央)考验科]，蒋黎(四川省医学科学院 四川省国民病院临床医学考验中央)，蒋廷旺(常熟市第二国民病院转化医学科)，柯江维(江西省儿童病院医学考验科)，李霖(四川省医学科学院 四川省国民病院临床医学考验中央)，李卿(上海市临床考验中央参考衡量尝试室)，李水军(上海市徐汇区中央病院中央尝试室)，李艳妍(吉林大学第一病院考验科)，廖璞(重庆市国民病院考验科)，刘华芬(杭州凯莱谱精准医疗检测本领有限公司)，刘靳波(西南医科大学附庸病院医学考验科)，卢丽萍(中国医科大学附庸盛京病院考验科)，闵迅(遵义医科大学附庸病院医学考验科)，倪君君(和合诊断集团探索院)，聂滨(宜宾市第二国民病院考验科)，潘柏申(复旦大学附庸中山病院考验科)，邱玲(中国医学科学院 北京协和病院考验科)，王成彬(总病院考验科)，王书奎(南京医科大学附庸南京病院医学考验科)，夏勇(广州医科大学附庸第三病院考验科)，徐元宏(安徽医科大学第一附庸病院考验科)，张传宝(国度卫生矫健委临床考验中央生化室)，张华(贵州省国民病院考验科)，赵蓓蓓(金域医学临床质谱检测中央)